CRISPR/Cas9: La Revolución Genética del Milenio

Del Descubrimiento del ADN al Logro de la Modificación Exitosa.

Contrario a lo que suele pensarse, el ADN no fue descubierto en la década de 1950 por James Watson y Francis Crick. La historia de este componente celular, se remonta a 1869, cuando el químico suizo Friedrich Miescher intentaba aislar e identificar las proteínas del núcleo de glóbulos blancos. Después de sus análisis, Miescher descubrió que las propiedades de la sustancia que aisló eran completamente diferentes a las de cualquier otra proteína, por lo que le dio el nombre de nucleína.

A pesar de la importancia de este descubrimiento, desconocida en aquellos tiempos, solo unos cuantos sintieron interés en investigar más acerca de la nucleína. Uno de ellos fue el bioquímico ruso Phoebus Levene, quien en 1919 propuso que la estructura de los ácidos nucleicos (ADN y ARN) está compuesta por una serie de nucleótidos, y que, a su vez, cada nucleótido está compuesto por una base nitrogenada, un azúcar y un grupo fosfato. Tiempo después, en 1944, Oswald Avery y colaboradores demostraron que las unidades hereditarias, o genes, estaban compuestas de ADN. Más adelante, en 1950, el bioquímico austriaco Erwin Chargaff, inspirado en el trabajo de Avery, decidió explorar otros aspectos de los ácidos nucleicos, descubriendo que los nucleótidos no tienen un orden fijo y que además se mantiene un balance en la cantidad de las diferentes bases nitrogenadas que existen.

Estos hallazgos, aunados al trabajo de cristalografía de rayos X de Rosalind Franklin y Maurice Wilkins, con quienes la comunidad científica tiene una deuda histórica de reconocimiento, contribuyeron al descubrimiento de la estructura doble helicoidal del ADN, propuesta por Watson y Crick en 1953.

Desde que fueron descubiertas las funciones y estructuras del ADN se han buscado mecanismos para hacer modificaciones en esta biomolécula. Los primeros intentos de modificación genética se realizaron en 1957, y, a pesar de ser insatisfactorios, permitieron comprender la importancia de la especificidad de los sitios de unión entre las estructuras sintéticas y el material genético a modificar, en otras palabras, que es importante que las estructuras sintéticas sólo se unan a un sitio en específico. En la década de los noventa, se desarrollaron otras metodologías que permitieron lograr la exitosa modificación genética, pero no derivaron en procedimientos muy robustos y de uso extendido dadas las dificultades de diseño y síntesis de los materiales a utilizar, aunado a las relativamente bajas tasas de eficiencia.

Genetic-editing
Foto: Shutterstock

En 1987, Ishino y colaboradores reportaron la presencia de repeticiones aglomeradas palindrómicas cortas regularmente interespaciadas (CRISPR, por sus iniciales en inglés) en el genoma de E. coli, pero se desconocía la función de estas secuencias. Tiempo después, comenzaron a observarse secuencias similares en otras especies de bacterias y archaeas. Adicionalmente se descubrieron secuencias adyacentes a estas repeticiones que codifican la producción de enzimas de corte de material genético. Pero a pesar de estos descubrimientos, se desconocía el propósito general de esta región del ADN de algunos microorganismos. No fue sino hasta 2005, que Bolotin y colaboradores y Mojica y colaboradores descubrieron que en la región CRISPR se encontraban embebidas secuencias de nucleótidos que no pertenecían a la célula, sino que eran parte del ADN de virus, y en específico a secuencias que se encargan de aportar información para la infección de células. Estos hallazgos permitieron formular la hipótesis de que CRISPR es una suerte de sistema inmune de las bacterias y archaeas, en las que las secuencias de CRISPR funcionan como una guía para unirse al ADN de los organismos invasores, y con ayuda de las proteínas Cas, las cuales son codificadas en la región cercana a las repeticiones, cortar el material genético e inactivarlo, para escapar del riesgo de la invasión.

El subsecuente estudio de este mecanismo de defensa derivó en la propuesta de una metodología para hacer modificaciones genéticas dirigidas. Si en principio se utiliza una pequeña secuencia como guía para cortar un material genético externo ¿por qué no escoger cuál secuencia se desea utilizar como guía y sintetizarla en el laboratorio? Se desató entonces una ola de estudios para lograr la modificación con CRISPR. Esto permitió ir descifrando el modo de operación del sistema. Se descubrió por ejemplo la importancia de una secuencia corta de entre tres y cinco pares de nucleótidos, conocida como secuencia adyacente a los protoespaciadores (PAM por sus iniciales en inglés), donde los protoespaciadores son las secuencias guías que dirigen el sitio de corte. Si no se reconocen las PAM, el corte no se lleva a cabo. Este paso adicional de reconocimiento es de vital importancia porque evita que se realicen cortes en el material genético propio, causando daño a la misma célula. Se han descubierto hasta ahora seis tipos diferentes de sistemas CRISPR, nombrados sistemas tipo I – VI. Las diferencias principales entre los diferentes sistemas radican en las proteínas encargadas de realizar el corte. El sistema tipo II es el más utilizado para realizar las modificaciones, dada la simplicidad de su funcionamiento. Básicamente solo debe diseñarse la secuencia guía y unirla a la secuencia PAM y la Cas9, proteína característica de este sistema.

Es así como se desarrolla esta nueva tecnología de “corte y confección” de material genético, siendo uno de los avances tecnológicos más prometedores de nuestros tiempos, con un fuerte énfasis en el ámbito de la medicina. CRISPR ofrece pues, la esperanza de corregir el material genético para prevenir o curar enfermedades hereditarias o para las cuales sólo existen hasta ahora métodos de control. El panorama se aprecia optimista, pues se han logrado modificaciones exitosas en células humanas, de ratones, ratas, moscas de la fruta, ranas, salamandras, monos, arroz, trigo, sorgo, tabaco, hongos y bacterias entre otros.

Hace unos meses, se publicó un artículo en la revista Science en el que se reporta la modificación exitosa de embriones humanos viables. El trabajo se enfocó en la corrección de un solo nucleótido, causante del síndrome de Marfan, una enfermedad que causa afectaciones en el corazón, huesos y articulaciones. Los autores no reportaron ningún corte en una zona no deseada. También existen estudios sobre el posible uso de CRISPR como tratamiento para la diabetes tipo 2, que de acuerdo a la OMS es la primera causa de muerte en México. CRISPR se ha convertido rápidamente, en una tendencia utilizada en grupos de investigación de México y el mundo.

Aunque se han reportado numerosos casos de éxito para esta tecnología es importante considerar que aún hay limitantes en el método. La primera es que existen algunas regiones del ADN que no cuentan con secuencias PAM, lo que supone una barrera para el uso de CRISPR/Cas9. La segunda, y probablemente la más importante es que, el sistema permite la unión de la secuencia guía con regiones que sean parecidas a el ADN a modificar, lo que disminuye la especificidad de los sitios de modificación. Si bien CRISPR/Cas9 ha representado un acercamiento al éxito en la modificación genética de manera sencilla, todavía restan obstáculos por superar para poder gozar de los potenciales beneficios que promete esta tecnología.


Referencias:

  1. Begley, S. Newest form of CRISPR corrects genetic disease in viable human embryos with few errors. STAT. 2018
  2. Carroll, D. (2011). Genome Engineering With Zinc-Finger Nucleases. Genetics. 2011. 188(4), 773-782. doi:10.1534/genetics.111.131433
  3. Doudna, J. A., & Charpentier, E. The New Frontier of Genome Engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014. 346(6213). doi:10.1126/science.1258096
  4. Guthrie, A., & Fleck, F.  Quality of care is key to tackling Mexico’s diabetes emergency. World Health Organization. Bulletin of the World Health Organization. 2017. 95(6), 393.
  5. Pray, L. Discovery of DNA structure and function: Watson and Crick. Nature Education. 2008 1(1):100
  6. Pyne, M. E., et al. Harnessing Heterologous and Endogenous CRISPR-Cas Machineries for Efficient Markerless Genome Editing in Clostridium. Scientific Reports. 2016. 6, 25666. doi:10.1038/srep25666
  7. Science. Watch CRISP edit genes in real time. 2017
  8. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature communications. 2017. 8(1), 1430.
  9. Zhao, D., et al. CRISPR/Cas9-assisted gRNA-free one-step genome editing with no sequence limitations and improved targeting efficiency. Scientific Reports. 2017 7(1), 16624. doi:10.1038/s41598-017-16998-8
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